Всего на сайте:
248 тыс. 773 статей

Главная | Медицина, Здоровье

ВЫДЕЛЕНИЕ И СИНТЕЗ ДНК  Просмотрен 17

Лабораторная работа № 4

ТЕМА: МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДНК

Цель работы: изучить методы рестрикционного картирования ДНК, блот-гибридизации по Саузерну, гибридизации in situ

Задание: изучить последовательность действий при составлении рестрикционной карты ДНК, записать выделенные термины, ответить на вопросы, сделать вывод об эффективности этого метода по определению структуры ДНК.

 

ВЫДЕЛЕНИЕ И СИНТЕЗ ДНК

ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, со­держащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис кле­ток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстраги­рование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирова­ние молекул ДНК путем преципитации в этаноле. Из 1 г сырой ткани или из 109 клеток обычно получают 2 мг ДНК.

У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 5 до 20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раство­ром, препятствующим коагуляции (например, с глюгициром или гепари­ном). Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядерные мем­браны добавлением буферных растворов, содержащих денатурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК дает применение протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией разрушен­ных белков. ДНК осаждают в этаноле и растворяют в буферном растворе.

Оценку качества экстрагированной ДНК проводят на основании измере­ния оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеино­вого спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280) > 1,8; где А(260) и А(280) - оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно. В противном случае про­цедуру очистки необходимо повторять, так как для успешного использо­вания и хранения ДНК белки должны быть полностью удалены.

В процессе сложного и многообразного функционирования различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные регулируемые и в основе своей обратимые изменения.

Эти модификации осуществляются с помощью специальных белков - ферментов.

Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК-полимеразами. И в бактериальных клетках, и в клетках эукариот содер­жатся три различные формы ДНК-полимераз, все они обладают синте­зирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК в направлении 5'-3', последовательно прибавляя по одному нуклеотиду к 3'-ОН-концу цепи, причем точность синтеза определяется специфичностью спарива­ния оснований. Таким образом, для работы ДНК-полимеразы необходи­ма однонитевая матричная ДНК с двухнитевым участком на 3'-конце молекулы. Кроме того, в среде должны присутствовать четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP: dATP, dCTP, dGTP и dTTP) - мо­лекул, состоящих из основания - А, С, G или Т, сахара - дезоксирибозы (d) и трех (Т) фосфатных остатков (Р). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полимераза α, а в клетках Е. coli — ДНК-полимераза III. ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3'-5', что позволяет им исправлять - репарировать — дефекты, допущенные при подборе комплементарных оснований. ДНК-полимераза I Е. coli способна инициировать реплика­цию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом ник-трансляции.

Предыдущая статья:Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) Следующая статья:РЕСТРИКЦИЯ ДНК
page speed (0.0171 sec, direct)