Всего на сайте:
248 тыс. 773 статей

Главная | Биология, Зоология, Анатомия

Изучение и описание кариотипа человека  Просмотрен 32

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

Цель работы: ознакомиться с основными методами определения кариотипа, структурными изменениями генома и хромосом, а также правилами записи кариотипа организмов.

Кариотип – полный набор числа хромосом соматической клетки, обладающих определенной формой и размерами, характерными для данного организма. Термин «кариотип» был введён в 1924 году советским цитологом Г.А. Левитским.

Важная особенность хромосом заключается в том, что хромосомы как индивидуаль­ные структуры становятся доступными для исследова­ния после значительного уко­рочения и утолщения, кото­рые они испытывают в период подготовки клетки к деле­нию. Для соматических клеток таким делением является метафазная пластинка митоза, для генеративных — метафазная пластинка сначала митоза, а затем мейоза.

Кроме того, исследуются только те метафазные хромосомы, хроматиды которых отделились друг от друга в области плечей, а в центромерной части еще соединены. Совокупность всех метафазных хромосом, расположенных относительно произвольно в экваториальной плоскости клетки, именуется метафазной пластинкой или просто хромосомным набором.

В 1960 – Мурхед и сотр. (США) разработали метод приготовления препаратов хромосом из кратковременной культуры лимфоцитов; в 1968-70 гг. разработаны методы дифференциального окрашивания хромосом, что позволило однозначно идентифицировать все хромосомы человека (рис. 1, рис. 2).

Рис. 1. Нормальный хромосомный набор женщины (в правом нижнем углу две X-хромосомы). Рис. 2. Нормальный хромосомный набор мужчины (в правом нижнем углу - Х- и Y-хромосомы).
 

После приготовления препаратов хромосом, которые можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки, хромосомы окрашиваются. После окрашивания их можно различить в световой микроскоп, получить микрофотографию, идентифицировать и, расположив их в определенном порядке, составить кариограмму, т.е. получить целостное представление о кариотипе конкретного человека.

Кариограмма - это те же хромосомы метафазной пластинки, но расположенные упорядоченно. Принцип упорядоченности общий для всего вида и определяется идиограммой.

Идиограмма - это графическое изображение гаплоидного набора хромосом (можно и диплоидного) и расположение их по группам в зависимости от формы и величины.

Группы располагаются в порядке уменьшения величины входящих в них хромосом. В современных цитогенетических лабораториях процесс составления кариограммы компьютеризирован.

Для кариотипа используется запись в системе Международной цитогенетической номенклатуры (International System for Cytogenetic Nomenclature) ISCN 1995, имеющая следующий формат:

 

1.количество хромосом

2.половые хромосомы

3. особенности.

Для обозначения половых хромосом у различных видов используются различные символы (буквы), зависящие от специфики определения пола таксона (различные системы половых хромосом). Так, у большинства млекопитающих женский кариотип гомогаметен, а мужской гетерогаметен, соответственно, запись половых хромосом самки XX, самца — XY. У птиц же самки гетерогаметны, а самцы гомогаметны, то есть запись половых хромосом самки ZW, самца — ZZ. Например, нормальный кариотип женщины: 46, XX; нормальный кариотип мужчины 46, XY. Длинное плечо хромосомы обозначают буквой q, короткое — буквой p.

Кроме диплоидного числа хромосом в кариотипе часто обозначают число двуплечих хромосом (мета- и субметацентрических); иногда при определении Ч.х.п. двуплечими считают и телоцентрические хромосомы. Для этого показателя применяют обозначение NF - число хромосомных плеч. Также для идентификации хромосом проводят морфометрический анализ длины хромосомы и соотношение их плеч (центромерный индекс).

С самого начала, при стандартном равномерном окрашивании хромосом была заметна некоторая неоднородность в плот­ности окрашивания по длине хромосом, однако это явление не имело объяснений. В конце 60-х годов XX века был осуществлен важный прорыв в исследовании хромосом, когда для их окрашивания начали использовать специальное контрастное вещество — акрихин-иприто. Такая окраска позволила выявить внутри хромосом большое число разных субструктур, которые не обнаруживались под микроскопом без окрашивания. После окрашивания хромосом красителем Гимза-Романовского они выглядят как зебры: вдоль всей длины видны поперечные светлые и темные полосы, имеющие окраску разной интенсивности.

Эти полосы получили название хромосомных G-сегментов или полос (рис. 3).

Рис. 3. Специфические хромосомные G-сегменты, выявляемые при окраске хромосом человека, и система их обозначения согласно решению международной конференции в Париже в 1971 году. Цифрами под хромосомами указаны их номера. X и Y — половые хромосомы, p — короткое плечо, q — длинное плечо хромосом

 

На Парижской конференции по стандартизации и номенклатуре хромосом человека (1971) все полученные к тому времени данные по дифференциальному окрашиванию хромосом были сопоставлены и оказалось, что все методы в принципе выявляют одни и те же структуры, но каждый специфичен в отношении определенных сегментов. И обозначать различные типы сегментов решили по методам, с помощью которых они выявляются.

Q-окрашивание — окрашивание по Касперссону акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом (быстрое определения генетического пола, выявление транслокаций между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, скрининг мозаизма с участием Y-хромосом)

G-окрашивание — модифицированное окрашивание по Романовскому-Гимзе. Чувствительность выше, чем у Q-окрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы)

R-окрашивание — используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

C-окрашивание — применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин и вариабельной дистальной части Y-хромосомы.

T-окрашивание — применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Картина сегментации сильно отличается у разных хромосом, но расположение хромосомных сегментов постоянно у каждой из хромосом во всех типах клеток человека. Природа полос, выявляемых при окраске, до конца еще не ясна. Сейчас установлено только, что участки хромосом, соответствующие темным полосам (названные R-полосами), реплицируются раньше, чем светлые участки (названные G-полосами). Хотя детальные процессы, происходящие при окрашивании, еще не до конца ясны, очевидно, что картина окраски зависит от такого параметра, как увеличенное или уменьшенное содержание в отдельных полосах хромосом АТ или ГЦ-пар.

Совершенствование методов окрашивания хромосом позволило выявить до 1000 полос на всех 23-х хромосомах человека, характерных для гаплоидного набора. В среднем на хромосому при этом приходится 50 полос, хотя на некоторых хромосомах их можно обнаружить в несколько раз больше, чем на других.

При описании кариотипа используются следующие обозначения:

Латинскими буквами р и q обозначаются соответственно короткое и длинное плечо, в каждом плече выделяются районы, обозначенные арабскими цифрами, районы нумеруются от центромеры к теломерным участкам хромосомы. А уже внутри района выделяются сегменты (англ. bands), обозначенные арабскими цифрами по такому же принципу, т.е. сегмент имеет свой символ, например, 1 q 32 - второй сегмент третьего района в длинном плече 1 -ой хромосомы (при чтении справа налево). Запись 5p15.2. означает: 2-я полоса 15-го участка короткого плеча 5-й хромосомы.

Сравнение комплексов поперечных меток хромосом помогает идентифицировать как гомологичные хромосомы, так и отдельные их участки, что позволяет детально определять хромосомные аберации — внутри- и межхромосомные перестройки, сопровождающиеся нарушением порядка фрагментов хромосом.

Различают следующие типы структурных изменений хромосом: транслокация - обмен участками в пределах одной хромосомы или между разными хромосомами; инверсия - перевертывание участков хромосом на 180°; дупликация - удвоение участков хромосом, инсерция - вставка в каком-либо участке нуклеотидной последовательности и делеция - потеря отдельных участков. В некоторых случаях хромосомные перестройки могут приводить к изменению числа хромосом или хромосомных плеч. Такие типы перестроек хромосом, центрические слияния и разделения, названы по имени цитогенетика К. Робертсона (Великобритания), который в 1916 году впервые их описал. Их называют робертсоновскими транслокациями. Хромосомные аберрации обозначаются дополнительными символами: делеция обозначается del, инверсия -inv, дупликация - dup, транслокация - t, инсерция – ins, кольцевая хромосома - r , iso - изохромосома по плечу, указанному в круглых скобках.

При описании структурных аномалий кариотипавначале, указывается общее количество хромосом, затем - набор половых хромосом, определяющих пол обследованного, после чего ставится запятая и приводится описание характера структурной перестройки: делеция, инверсия, дупликация, транслокация, инсерция. После этого, в скобках, указывается номер хромосомы, например: 46,XY, del(2) означает потерю участка на второй хромосоме у мужчины. Запись 46,XY,del (2)(2q 14.1) более детальная и означает, что произошел разрыв в первой субъединице четвертого сегмента первой полосы длинного плеча второй хромосомы.

При межхромосомных обменах после запятой указывают номера хромосом, вовлеченных в перестройку. Если в перестройку были вовлечены две хромосомы (и более), то для отделения их друг от друга ставится точка с запятой и первой записывается хромосома, имеющая меньший номер. В том случае, если удается идентифицировать сегменты, подсегменты и полосы хромосом, в которых произошли разрывы, то они указываются в следующих скобках. Например, кариотип мужчины с транслокацией 21-х участков короткого (p) и длинного плеч (q) 1-й и 3-й хромосом и делецией 22-го участка длинного плеча (q) 9-й хромосомы (приведён на рис. 4): 46, XY, t(1;3)(p21;q21), del(9)(q22)

Рисунок 4.

Кроме структурных изменений самих хромосом может меняться и количество хромосом. Клетки разных тканей даже одного организма в зависимо­сти от выполняемой функции могут содержать разное число хромосом. Так, например, в клетках печени животных бывает большее, чем два, число наборов хромосом (т. е. 4n, 8n). Некоторые виды растений могут быть представлены формами, отличающимися числом хромосом, кратным гаплоидному. Так, рожь ( Secale cereale) может иметь 2 n (14 хромосом) или 4n (28 хромосом). При этом все видовые признаки у обеих форм ржи сохраняются.

Такое явление - увеличение числа хромосом в организмах одного биологического вида сверх диплоидного числа (2n), кратно гаплоидному числу хромосом: 3n, 4n и т. д. называется полиплоидией. Полиплоидия была открыта Э. Страстбургером (Германия) в 1910 году. Полиплоидия регулярно встречается у растений и редко у животных (только у холоднокровных). Различают автополиплоидию (удвоение собственного набора хромосом) и аллополиплоидию— соединение в одном биологическом виде диплоидных хромосомных наборов двух видов-предшественников. Существует также анеуплоидия — некратное изменение числа хромосом: потеря или добавление в хромосомном наборе отдельных хромосом. Все типы изменения числа хромосом объединяются понятием геномные перестройки.

В случае численных аномалий хромосом (полиплоидии) первым приводится общее количество хромосом, кратное гаплоидному. Например:

- триплоидный кариотип человека записывается так: 69,ХХУ или 69,ХХХ;

- кариотип лошади с «лишней» X-хромосомой (трисомия по X-хромосоме): 65, XXX;

При наличии анеуплоидий по аутосомам после указания общего количества хромосом и пола человека ставится знак «+» при увеличении количества хромосом в одной паре или знак «—» при уменьшении. Например, трисомия по 18 хромосоме у мужчины записывается как: 47,XY,+18, а моносомия по 13 хромосоме в женском кариотипе записывается как 45,ХХ,-13. Напомним, что полная моносомия по любой аутосоме летальна и может определяться только у абортусов и мертворожденных.

Несколько по-иному записываются количественные перестройки, затрагивающие половые хромосомы. Если произошло увеличение или уменьшение числа половых хромосом, то знак «+» или «-» не ставится, а просто записываются их символы в необходимом количестве.

Хромосомные перестройки могут обнаруживаться во всех клетках организма (полная форма хромосомного синдрома) или в определенном клоне клеток (мозаичная форма).

Полные формы хромосомных аномалий могут быть унаследованы от родителей, при наличии носительства ими хромосомной перестройки или возникать de novo в одной единственной гамете, давшей начало новому организму.

Появление мозаицизма обусловлено возникновением мутаций в зиготе, сформированной нормальными гаметами в процессе клеточного деления во внутриутробном периоде. При обнаружении мозаицизма обозначение кариотипов различных клеточных клонов разделяются косой чертой (/). Например, запись кариотипа 45,Х/47,ХХХ (50%/50%) означает, что при цитогенетическом исследовании препарата обнаружены два клона клеток — один с моносомией по Х-хромосоме, а другой с трисомией по Х-хромосоме, в соотношении 1:1. Согласно требованиям современной номенклатуры в конце записи в квадратных скобках должны быть указаны абсолютные количества клеток в клоне каждого типа, обнаруженные при цитогенетическом исследовании.

Некоторые болезни, вызванные аномалиями кариотипов человека:

Синдром Клайнфельтера (полисомия по X-хромосоме у мужчин): 47,XXY; 48,XXXY;

Синдром Шерешевского — Тёрнера (моносомия по X хромосоме, в том числе и мозаицизм):

45X0; 45X0/46XX; 45,X/46,XY; 46,X iso (Xq)

Полисомии по X хромосоме (наиболее часто — трисомия): 47,ХХX; 48,ХХХХ; 49,ХХХХХ X;

Синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме): 47,ХХ, 21+; 47,ХY, 21+ ;

Возможен также вариант синдрома Дауна, в основе которого лежит транслокационная форма трисомии по типу робертсоновской перестройки, в которую вовлекаются акроцентрические хромосомы. Кариотип такого больного включает пару нормальных хромосом 21 и третью 21-ю хромосому (либо ее фрагмент), которая является частью структуры хромосомы из другой пары, например хромосомы 15;

Синдром Эдвардса (трисомия по 18-й хромосоме): 47,ХХ, 18+; 47,ХY, 18+;

Синдром Патау (трисомия по 13-й хромосоме): 47,ХХ, 13+; 47,ХY, 13+;

Синдром кошачьего крика (делеция короткого плеча 5-й хромосомы): 46,XX, 5р-;

Синдром Прадера-Вилли(аномалия 15 хромосомы): 46 XX или ХУ, 15р-.

Синдром де Груши (18p-) описан в 1964 г. Характеризуется микроцефалией, нарушениями лицевого скелета, умственной отсталостью, аномалиями половых органов.

Синдром Фурлин (11q-), описанный в 1975 г., проявляется в задержке роста и психомоторного развития, тригоноцефалии, аплазии дистальных фаланг пальцев рук.

При появлении кольцевой хромосомы 9 (r9) наблюдаются микроцефалия, косой разрез глаз, эпикантус, небольшой экзофтальм, дугообразные брови, короткая шея, умственная отсталость.

 

Выполните задания:

1. При изучении фотокопии хромосомного комплекса человека были проведены измерения и определены следующие относительные размеры короткого (р) и длинного (q) плеча отдельных хромосом (p/q):

1) 3,1/4,9; 2) 1,7/4,3; 3) 1,7/3,3; 4) 0,6/3,0; 5) 1,2/2,1; 6) 0,6/1,4.

1. Рассчитайте центромерный индекс (в %) для каждой из указанных выше хромосом исследуемого кариотипа по формуле: р/(р + q).

2. В нормальном кариотипе человека присутствуют 44 аутосомы и 2 половые хромосомы (XX или XY). В случае одной из форм истинного гермафродитизма (наличие у индивидуума одновременно мужских и женских половых желез) в организме обнаруживают мозаицизм, т.е. два клона клеток, отличающихся по составу половых хромосом (XX/XY). Сделайте символическую запись нормального кариотипа женщины и мужчины. Сделайте запись кариотипа человека с истинным гермафродитизмом.

3. Укажите знаками (+) либо (-) против каждого из наборов хромосом соответствующие им характеристики, заполнив табл. 1. Схематическая запись различных наборов хромосом

Набор хромосом n 2n Пол Диплоидный набор Гаплоидный набор Соматические клетки Половые клетки
жен. муж.      
46, XY       
46,ХХ       
23,X       
23,Y       
       

4. Расшифруйте следующие условные обозначения: 1) 3р 13; 2) 3q29; 3) 3p26; 4) 4p14; 5) 4q26; 6) 4q13. Отметьте стрелками соответствующие сегменты на схеме этих хромосом (рис. 5,а).

Рисунок 5, а. Рисунок 5, б.

 

5. На рис. 5, б приведена схема 11-й хромосомы человека, на которой картирован ген инсулина, локус гена имеет координаты 11p5. Найдите место этого гена на хромосоме.

 

6. Используя информацию табл. 2, определите, с каким видом нарушений связаны перечисленные кариотипы человека и укажите свой ответ знаками (+) либо (-) в соответствующей графе.

Предыдущая статья:Лабораторная работа 2 Следующая статья:Строение нуклеотидов
page speed (0.015 sec, direct)