Всего на сайте:
236 тыс. 713 статей

Главная | Химия

Определение активности рибонуклеазы  Просмотрен 445

 

Принцип методаРибонуклеаза — это фермент, расщепляющий полимерную молекулу РНК на низкомолекулярные фрагменты, количественное определение которых проводят при 260 нм.

Реактивы:1) раствор дрожжевой РНК (1 мг/мл) в ацетате натрия (0,1 моль/л); 2) водный раствор панкреатической РНКазы, 0,2%; 3) спирто-магниевый осадитель — 80% раствор этанола, содержащий 0,01 моль/л MgСI2.

Ход работыК 0,4 мл раствора дрожжевой РНК в центрифужную пробирку вносят 0,2 мл раствора РНКазы (в качестве источника фермента можно использовать 5% водные гомогенаты тканей объемом 0,5 мл, а также разбавленную в 10 раз слюну), перемешивают и помещают в термостат на 30-60 мин при 37 °С. В пробирку вносят 1 мл спирто-магниевого осадителя и помещают на ледяную баню. Через 1 ч образуется осадок РНК, который удаляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. Затем отбирают 2—3 пробы надосадочной жидкости (0,5 мл), прибавляют к каждой по 3 мл дистиллированной воды, перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм против воды. Прирост поглощения в опытной пробе по отношению к контрольной (DА260) служит показателем активности РНКазы и используется для расчета активности фермента по формуле

А=А260*V1V2/V3tW, где V1объем пробы после разбавления; V2 объем пробы после осаждения РНК спирто-магниевым раствором; V3объем надосадочной жидкости; DА260 — прирост оптической плотности опытной пробы по отношению к контрольной; t — время инкубации, мин; Wмасса белка (фермента) в пробе, мг.

Результат: ______________

________________

Предыдущая статья:Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот Следующая статья:Определение активности дезоксирибонуклеазы
page speed (0.0134 sec, direct)