Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот   510

Принцип методаВ основе спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А.С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм.

Реактивы:

НС1О₄, 0,2 н. и 0,5 н. растворы.

Ход работы100—200 мг измельченной на холоду ткани помещают в центрифужную пробирку с 5—10 мл охлажденного 0,2 н. раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при охлаждении. Центрифугат отбрасывают и осадок повторно отмывают хлорной кислотой. Такая обработка необходима для удаления кислоторастворимых нуклеотидов. К осадку добавляют 5—10 мл 0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин. Эта процедура необходима для количественной экстракции нуклеиновых кислот из исследуемой ткани и кислотного гидролиза. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют. Осадок подвергают повторной экстракции 0,5 н. раствором хлорной кислоты. Гидролизаты объединяют, учитывают объем и определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против 0,5 н, раствора хлорной кислоты. При необходимости гидролизат разводят тем же раствором.

Рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора по формуле: C_{фосфора} = (А₂₇₀-А₂₉₀)/0,19 мкг- где 0,19 — значение _DА (А₂₇₀ - А₂₉₀), которое имеет гидролизат нуклеиновых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора. При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения. Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются пересчетным коэффициентом 10,3: С_нк = С_{фосфора} *10,3 (мкг).

Результат: ______________

________________