Всего на сайте:
210 тыс. 306 статей

Главная | Химия

Этапы циклизации  Просмотрен 275

I этап — денатурация.Реакционную смесь нагревают до температуры 90 °С в течение нескольких минут. Нагревание приводит к разрыву слабых связей между основаниями молекулы ДНК и образованию из исследуемой двухцепочечной матричной ДНК одноцепочеч-ных молекул.

II этап — гибридизация ДНК с праймерами.Температуру снижают до 30—50 °С. При этой температуре возможна специфическая гибридизация цепей ДНК с праймерами.

III этап - элонгация (полимеризация).Это синтез последовательностей, комплементарных матричной ДНК. При температуре 60—70 °С, оптимальной для работы Таg-полимеразы, начинается полимеразная цепная реакция. Перемещаясь по матрице в направлении 5'-конца, Таg-полимераза удлиняет праймер, присоединяя к нему один за другим нуклеотидные остатки, комплементарные нуклеотидам матрицы.

Дальнейший процесс ПЦР заключается в чередовании циклов. Продолжительность каждого цикла зависит от длины и первичной структуры амплифицируемого участка, но, как правило, не превышает 3—5 мин.

За каждый цикл происходит двукратное увеличение числа синтезированных копий, т. е. содержание продуктов амплификации в реакционной смеси нарастает в геометрической прогрессии.

Этот трехступенчатый цикл может быть повторен многократно, пока не образуется достаточно материала, необходимого для дальнейших исследований.

Полученный материал подвергают фракционированию методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Разработаны специальные полиакриламидные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающихся только на один нуклеотид.

По сравнению с традиционными методами диагностики данный метод позволяет проводить быструю, чувствительную и специфическую идентификацию генетического материала.

В медицинской диагностикепри помощи этого метода можно решать многие вопросы:

* Идентифицировать вирусную и бактериальную ДНК в составе ДНК человека.

* Проводить пренатальную диагностику наследственных болезней.

* Выявлять гетерозиготных носителей дефектных генов.

* Определять точную локализацию генов в ДНКчеловека.

* Идентифицировать дефектные гены, нарушающие регутяцию пролиферации клеток и вызывающие развитие опухолевых заболеваний.

*Проводить анализ и идентифицировать препараты, содержащие сильно деградированную ДНК.

Предыдущая статья:Теоретические основы ПЦР Следующая статья:Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
page speed (0.0103 sec, direct)